En la cuerda floja
En la cuerda floja

En la cuerda floja (1984)

115 min 1984

Los métodos de molécula única para resolver problemas biofísicos dinámicos han demostrado ser herramientas poderosas que permiten la observación simultánea dinámica y estática de múltiples interacciones moleculares en presencia de múltiples factores promediadores de conjuntos. Aquí, ofrecemos protocolos completos para construir una prueba de cuerda floja de ADN en la cuerda floja utilizando microscopía de rayo láser de un solo átomo junto con ensayos de cuerda floja de ADN de una sola molécula. Desarrollamos un protocolo de ensamblaje de interruptor biológico basado en ADN en la cuerda floja basado en dos eventos independientes de unión al ADN. En este protocolo, demostramos la capacidad de un conjunto de múltiples eventos de unión al ADN en la cuerda floja para combinarse para formar la unión específica de secuencia requerida del dominio de unión al ADN. Nuestro estudio proporciona una nueva demostración de la unión de ADN dependiente de la secuencia en una única reacción dinámica molecular.

La técnica de la cuerda floja se ha utilizado con éxito para investigar la interacción molecular en una serie de experimentos. Esta técnica se puede utilizar para establecer enlaces moleculares mediante interacciones químicas y ópticas. La técnica se ha aplicado para investigar la cinética y la dinámica de las estructuras del ADN mediante una amplia gama de métodos que incluyen mediciones bioquímicas y ópticas. En nuestro estudio, empleamos esta técnica en la cuerda floja en la investigación de la unión del ADN en ausencia de los dominios de unión al ADN de las enzimas que catalizan la formación de acetil-CoA.

Cuando no hay un evento de unión al ADN, el ADN se unirá solo a sí mismo, lo que dará como resultado un receptor estable, no acoplado a proteínas en presencia de luz. Se ha visto que la cantidad de unión de ADN aumenta de forma predecible en función de la longitud de onda. Por ejemplo, cuando una molécula de ADN se excita con una luz azul fuerte, se puede observar un aumento significativo en la unión. Además, esta luz puede penetrar en el ADN e interactuar con el ADN a una frecuencia en la que el ADN y la molécula no interactúan entre sí.

Se puede utilizar una técnica de unión de ADN en la cuerda floja para determinar la velocidad exacta a la que una molécula de ADN se une a sí misma y a otras moléculas. La velocidad a la que la molécula se une a sí misma será proporcional al tamaño de la molécula de ADN. Un experimento de unión solo dará una medida de la unión de una sola molécula de ADN a sí misma. Para medir la velocidad a la que la molécula se une a otras moléculas, diseñamos un evento de unión específico de secuencia que depende de la secuencia de las moléculas involucradas, sus posiciones y su distancia de la molécula.

Los eventos de unión se cuantifican contando el número de eventos de unión. Un evento de unión se define como una serie de eventos en los que la molécula se une a sí misma oa otra molécula. Este número se expresa luego como el número promedio de eventos de unión por molécula, denominado número de eventos de unión por molécula por unidad de longitud de ADN.

El evento de unión de secuencia específica, cuando se compara con la unión de una molécula de ADN desacoplada, es una medida de la unión de una molécula independiente al ADN. Se utilizó la técnica de la cuerda floja para determinar la unión específica de secuencia del ADN y para verificar la unión de una sola molécula a su pareja.

Título original: Tightrope
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